DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE HEMOFILIA B EN 15 HORAS A PARTIR DE UN ÚNICO CABELLO

F. Vidal, E. Farssac, C. Altisent*, L. Puig*, D. Gallardo. Unitat de Recerca, Centre de Transfusió i Banc de Teixits. *Unitat d'Hemofília, Hospital General Vall d'Hebron. Barcelona.

La hemofilia B está causada por el déficit total o parcial de la actividad del factor IX (FIX) de coagulación, habiéndose descrito más de 600 mutaciones en el gen que lo codifica. La secuenciación es sin duda el método más adecuado para caracterizar el defecto genético. Sin embargo, y dado que se ha considerado tradicionalmente una tecnología cara, complicada y laboriosa, el análisis de ligamiento y el cribado de mutaciones siguen siendo las técnicas de elección en muchos laboratorios. Con el objetivo de mejorar el diagnóstico molecular de la hemofilia B hemos puesto a punto un protocolo para la caracterización del gen FIX que ha demostrado ser extremadamente simple, rápido y sensible. Utilizamos como fuente de DNA genómico un único cabello procedente de un paciente hemofílico y de un individuo sano usado como control. Mediante el uso de oligonucleótidos especialmente diseñados para obtener un elevado rendimiento y especificidad bajo idénticas condiciones de amplificación, obtuvimos 7 productos de PCR conteniendo las regiones esenciales del gen FIX. Dichos productos, que incluyen el promotor, los 8 exones y sus correspondientes regiones de splicing, fueron purificados por columna y secuenciados ajustando los tiempos de electroforesis a cada reacción. De acuerdo con lo esperado, la secuencia del individuo sano resultó ser completamente normal. El paciente hemofílico mostró una mutación puntual C>T que da lugar al cambio de una Arg por un codón STOP en la posición 252. El procedimiento completo desde la obtención del cabello hasta la identificación de la mutación fue realizado en unas 15 horas, de las cuales 3 correspondieron al tiempo real de manipulación. Los resultados fueron similares cuando se partió de muestras de sangre periférica. Esta técnica es fácilmente escalable si se dispone de aparataje con mayor capacidad de procesamiento, pudiendo ser analizados un gran número de pacientes de forma simultánea. En conclusión, presentamos un procedimiento rápido, simple, sensible y económico para la secuenciación directa del gen FIX. Este método garantiza un diagnóstico molecular certero en pacientes afectos de hemofilia B y una fiabilidad del 100% en los estudios familiares.