DETECCIÓN CUANTITATIVA RÁPIDA DEL REORDENAMIENTO PML/RARa MEDIANTE SONDAS DE HIBRIDACIÓN

E Barragán (1), P Bolufer (1), I Moreno (1), E Afán de Ribera (1)G Martín (2), M A Sanz (2)

(1) Laboratorio de Biología Molecular. Departamento de Biopatología Clínica Hospital La Fe Valencia. (2) Servicio de Hematología. Hospital La Fe Valencia

El reordenamiento PML/RARa es un rasgo específico y selectivo de la leucemia promielocítica aguda (LPA). La incorporación de las nuevas técnicas cuantitativas de PCR en tiempo real permitiría evaluar la enfermedad mínima residual (EMR) en cada paciente estableciendo un perfil cinético del clon leucémico. Presentamos un método cuantitativo de PCR en tiempo real mediante sondas de hibridación para detectar el reordenamiento PML/RARa. Se han seleccionado dos cebadores específicos sobre PML y uno común sobre RARa para detectar los tres tipos de transcritos (bcr1, bcr2 y bcr3) y un par de sondas de hibridación, una donante marcada en 3’ con fluoresceina y otra aceptora marcada en 5’ con Red 640. Para normalizar la expresión del transcrito PML/RARa se ha utilizado el gen de control AML. Las curvas patrón se prepararon con diluciones de los productos PML/RARa y AML clonados en el plásmido pCR II-TOPO (Invitrogen). La PCR se realizó con el kit Ligtcycler Fast Start DNA Master Hybridization Probes, empleando una concentración de sondas 0.2 µM y 0.3 µM de cebadores, en un tiempo total de 45minutos. Con esta técnica se han podido detectar hasta 22 copias del plásmido que contiene el reordenamiento PML/RARa. La sensibilidad evaluada mediante diluciones de cDNA de dos pacientes con el transcrito bcr1 y bcr3, ha llegado a detectar el reordenamiento hasta la dilución 5.10-4. La reproducibilidad intraensayo obteniénda mediante 10 repeticiones de una misma muestra arroja un cv para PML/RARa de 0.25% (23.97± 0.06 ciclos) en el umbral de ciclos (Uc) y del 4.5% (12980 ± 585fg/µl) cuando se expresa en concentración y para el gen control AML de 0.44% (20.15± 0.09 ciclos) en Uc y 4.8% (2248± 109.8 fg/µl) en concentración. La cuantificación de muestras de pacientes positivos en distintas etapas de la enfermedad ha detectado un cociente PMLRAR/AML medio de 6.1 en las muestras al diagnóstico, de 0.22 después de la inducción y de 0.008 tras la consolidación. El estudio retrospectivo en un paciente que durante el mantenimiento sufrió una recaída molecular y al mes recayó hematológicamente muestra una detección precoz con el método cuantitativo y una expansión del clon leucémico hasta el momento de la recaída. Conclusiones: 1) El método permite la detección cuantitativa rápida, específica, reproducible y sensible del reordenamiento PML/RARa. 2) El método cuantitativo permite evaluar la eficacia del tratamiento terapéutico. 3) El perfil cinético permitiría predecir la recaída mediante la expansión del clon leucémico.

Agradecimientos: Este estudio ha sido parcialmente financiado gracias a la ayuda FIS al proyecto 99/0806