(1) P Bolufer, (2) G Sanz, (1) E Barragán, (2) MA Sanz, (1) I Moreno, (2) J Cervera, (2), L Senent, (2) A Regadera. (1) Laboratorio de Biología Molecular (Departamento de Biopatología Clínica). (2) Hematología Clínica (Servicio de Hematología). Hospital Universitario La Fe. Valencia.
La leucemia mieloide crónica (LMC) se caracteriza por la presencia del reordenamiento BCR-ABL consecuencia de la t(9;22) que es un ejemplo de la utilidad de los métodos moleculares en el diagnóstico y monitorización del tratamiento (Swayers CL. New Engl J Med 1999;340:1330). El valor limitado de la determinación cualitativa de RT-PCR, en el post-trasplante (Cross NCP et al. Blood 1993; 82:1929) o tras tratamiento con interferón-a (INFa ) (Maligne MC et alBr J Haematol 1992;82:701) ha justificado el desarrollo de ensayos cuantitativos. Con el advenimiento de la tecnología de PCR en tiempo real se han descrito métodos cuantitativos utilizando sondas TaqMan empleando el equipo ABI/Prism 7700 (Perkin-Elmer) (Mensik E et al Br J Haematol 1998;102:768, Eder K et al Leukemia 1999;13:1383). Aquí se describe la puesta a punto de un método de PCR en tiempo real basado en el empleo de sondas de hibridación marcadas con fluorógenos empleando la tecnología del LightCycler (Roche). El ensayo emplea los cebadores de Mensik et al (Br J Haematol 1998;102:768) y una pareja de sondas compatibles con los mismos (Bcr-abl 3 FL marcada con fluoresceína y Bcr-abl 5LC, marcada con Red640), ambas ubicadas sobre el gen ABL vecino al punto de ruptura. Como gen de control se amplifica el ABL con los cebadores A2 y CA3- de Cross NC et al (Brit J Haematol 1993;84:67) empleando sondas marcadas con fluorógenos (bcrabl 3FL y bcrabl 5LC). El PCR se realiza en 10 m l, empleando una concentración 0.45 m M de los cebadores a, 0.2 m M de las sondas, 3 mM de Cl2Mg, 1 m l del mastermixt LightCycler DNA Hybridization probes, 0.5 m l de Uracil-DNA glicosilasa y 2 m l del cDNA de cada muestra o punto de la curva patrón. El programa de PCR realiza 45 ciclos y tiene una duración de 50 min efectuando las lecturas de la fluorescencia (F2/F1) en el anillamiento. Las curvas patrón se preparan mediante diluciones seriadas 10-1 entre 10-3 a 10-7 de plasmidos PCR-II-TOPO (Invitrogen) en los que se han clonado productos de PCR de BCRABL o de ABL. Se hace un estudio retrospectivo que incluye 69 muestras de sangre periférica de 10 pacientes positivos para BCRABL (9 LMC y 1 LMA Ph+). Los productos de amplificación generados tienen 310 pb el b3a2, 239 pb el b2a2 y 250 pb el abl. Los coeficientes de correlación obtenidos en 5 curvas consecutivas han sido > 0.96, obteniendo para BCRABL una pendiente media (media± ds) de 4.04± 0.40 y término independiente de 39.19± 2.01. Para ABL la pendiente media es de 4.53± 0.49 y término independiente de 41.04± 2.19. Los resultados finales se expresan como cociente porcentual de BCRABL/ABL. El método de BCRABL tiene una sensibilidad que permite detectar 1000 copias del plasmido b3a2 y 40 del b2a2. El transcrito se detecta hasta la dilución 1:50.000 de la línea celular K562 (células o RNA). El cv intraensayo de BCRABL efectuada realizando 10 repeticiones de la misma muestras es de 0.64% para el umbral de cilos (Uc) y del 11% cuando se expresa en concentración. Para ABL se obtiene un cv del 0.49% para el Uc y 9% para los resultados expresados en concentración. El cociente BCRABL/ABL de los pacientes al diagnóstico es del 31± 19% y se reduce significativamente a 0.2± 0.3% en las muestras positivas del post-trasplante allogénico inmediato. Los resultado de monitorización cuantitativa se corresponden con el perfil clínico y biológico (FISH, quimerismos) de estos pacientes. Se concluye que el método presentado tiene suficiente sensibilidad, especificidad, reproducibilidad y rapidez para su empleo en el diagnóstico y monitorización de los pacientes con LMC, tal como lo acreditan los resultados obtenidos en el grupo de pacientes estudiado.Este estudio está promovido gracias a la ayuda FIS concedida al proyecto de investigación 99/0806