P Bolufer, E Barragán, MA Sanz por el Comité de Estandarización y Monitorización Molecular de la Leucemia Promielocítica Aguda (*)
(*) P Bolufer, E Barragán, R Bornstein, D Colomer, MD, Delgado, M González, R García, B Martinez, I Marugan, J Román, MT Gómez, A Villegas, E Anguita, JM de Blas Orlando, MJ Calasanz, JL Vizmanos, MD Delgado, M García, P Cabello, L Hermosin
El desigual significado de la positividad molecular del reordenamiento PML/RARa dependiente de la sensibilidad del método empleado ha motivado que el programa de control de calidad externo de la detección del reordenamiento PML/RARa, desarrollado para control de los resultados de los laboratorios de referencia involucrados en el protocolo PETHEMA LPA-96, haya estudiado la sensibilidad de los laboratorios y/o métodos. Este estudio se ha realizado en cuatro envíos sucesivos llevados a cabo desde octubre de 1998 hasta marzo del 2000. Los dos primeros envíos (4º y 5º) consistieron en diluciones 10-1 de ARN de la línea celular NB4 en ARN carente del reordenamiento, desde 10-2 a 10-5. En el envío 6º se incluyeron diluciones de células NB4 en células HL60, sin diluir y a los títulos de 10-2 y 10-3. Finalmente, en el envío 7 se emplearon diluciones desde 10-3 a 10-5 de dos plasmidos conteniendo insertos de bcr1 y bcr3 procedentes de productos de PCR obtenidos con los cebadores de Biondi A et al (Blood 1992; 80:492). En el envío 4º se recogen resultados de 15 laboratorios, 17 en el 5º y 14 en el 6º. En el 7º envío el espectro de los laboratorios se redujo a 7 debido a que los insertos clonados no eran compatibles con muchos de los cebadores utilizados. Diez de los laboratorios siguen el método de Biondi A et al, 5 el de Borrow J et al (Br J Haematol. 1992; 82: 529) y los tres restantes siguen los métodos de Huang W et al (Blood 1993; 82:1264), Miller WH et al (Blood 1993; 82:1689). y Castaigne S et al (Blood 1992;79:3110). La casi totalidad de los laboratorios detectan el transcrito en las muestras de ARN sin diluir y a la dilución 10-2, pero a partir de la dilución 10-3 va aumentando la proporción de resultados negativos. El reordenamiento se detecta en la muestra celular de NB4 sin diluir y a la dilución 10-2, pero algunos laboratorios no lo detectan a la dilución 10-3. La sensibilidad de los laboratorios que siguen el método de Biondi et al se sitúa entre 10-2, en que la mayoría detecta el reordenamiento y 10-3, en que solo lo detecta una mitad. Esta sensibilidad es un log inferior a la observada para los laboratorios que siguen los método de Borrow J et al y los tres métodos restantes. El reordenamiento solo se pudo detectar en las muestras de menor dilución de ADN plasmídico (10-3) que corresponden a 604.302 copias/m l de bcr1 y a 1.022.666 copias/m l de bcr3. Sin embargo, solo una mitad de los participantes detectan los transcritos a la dilución 10-4 y ninguno en la dilución 10-5. En este 7º envío un total de tres laboratorios han efectuado la determinación mediante PCR en tiempo real y dos de ellos han realizado también su método de RT-PCR habitual. Los resultados preliminares sugieren que ambos procedimientos tienen una sensibilidad similar. Los resultados obtenidos permiten concluir: (a) Los métodos empleados en la detección del reordenamiento PML/RARa son capaces de amplificar el transcrito entre las diluciones 10-3 a 10-4 de ARN de NB4, (b) El método de Biondi tiene una sensibilidad casi un log inferior al del resto de los métodos lo que permite detectar el transcrito entre las diluciones 10-2 a 10-3 de ARN de NB4, (c) Los resultados preliminares indican que la sensibilidad global de los métodos permite detectar 60.430 copias/m l para bcr1 y 102.266 copias/m l para bcr3. La cuantificación de niveles de transcrito mediante la tecnología del PCR en tiempo real podría resolver los problemas de la desigual sensibilidad de los métodos cualitativos convencionales.
Este estudio está parcialmente financiado con la ayuda FIS concedida al proyecto de investigación 99/0806.