DETECCIÓN CUANTITATIVA RÁPIDA DEL REORDENAMIENTO AML1/ETO MEDIANTE SONDAS DE HIBRIDACIÓN
E Barragán (1), P Bolufer (1), I Moreno (1), G Martín (2), M A Sanz (2), J Nomdedeu (3), S Brunet (3).
(1) Laboratorio de Biología Molecular. Departamento de Biopatología Clínica Hospital La Fe Valencia. (2) Servicio de Hematología. Hospital La Fe Valencia (3) Servicio de Hematología. Hospital San Pau Barcelona.
Las técnicas convencionales de RT-PCR han permitido detectar el reordenamiento AML1/ETO en un 7-10% de las LMA al diagnóstico y en un 20% de los casos de LMA-M2. Estos métodos han demostrado la presencia del reordenamiento AML1/ETO en pacientes en larga remisión completa. Esta persistencia no asociada con la recaída limita la utilidad clínica de las técnicas convencionales de RT-PCR. Por esta razón resulta interesante la introducción de nuevas técnicas cuantitativas. Presentamos un método cuantitativo de PCR en tiempo real mediante sondas de hibridación para detectar el reordenamiento AML1/ETO. Para amplificar el reordenamiento se han seleccionado unos cebadores específicos que generan un amplicón de 213 pb y un par de sondas de hibridación, una donante marcada en 3 con fluoresceina y una aceptora marcada en 5 con Red640. Para normalizar la expresión del transcrito AML1/ETO se ha utilizado el gen de control AML. Las curvas patrón se prepararon con diluciones de los productos AML1/ETO y AML clonados en el plásmido pCR II-TOPO (Invitrogen). La PCR se realizó con el kit Ligtcycler Fast Start DNA Master Hybridization Probes, empleando una concentración de sondas 0.2 µM y 0.3 µM de cebadores, en un tiempo total de 45minutos. Con esta técnica se han podido detectar hasta 11 copias del plásmido que contiene el reordenamiento AML1/ETO. La sensibilidad evaluada mediante diluciones de cDNA de la línea Kasumi-1, ha llegado a detectar el reordenamiento hasta la dilución 10-5. La reproducibilidad intraensayo obtenida efectuando 10 repeticiones de la misma muestra arroja un cv para AML1/ETO de 0.32% (21.43 ± 0.07 ciclos) en el umbral de ciclos (Uc) y del 4% (4953 ± 195.2 fg/µl) cuando se expresa en concentración y para el gen control AML de 0.46% (21.38± 0.1ciclos) en Uc y 6.6% (1556± 103.5 fg/µl) en concentración. La eficacia del método se ha probado cuantificando muestras de pacientes positivos en distintas etapas de la enfermedad. En las muestras al diagnóstico el cociente AML1ETO/AML medio fue de 3.53, mientras que en las muestras de pacientes en remisión completa el ratio fue de 0.04. Conclusiones: 1) El método permite la detección cuantitativa rápida y específica del reordenamiento AML1/ETO. 2) Tiene sensibilidad y reproducibilidad suficiente para aplicarlo en la detección de enfermedad mínima residual, y al realizar una única PCR reduce los riesgos de contaminación de las técnicas de RT-PCR convencional. 3) El perfil cuantitativo de un paciente permite evaluar la eficacia del tratamiento.Agradecimientos: Este estudio ha sido parcialmente financiado por la ayuda FIS al proyecto 99/0806.