CUANTIFICACION DEL REORDENAMIENTO TEL/AML1 MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL CON EMPLEO DE SONDAS MARCADAS CON FLUOROGENOS

P Bolufer (1), E Barragan (1), E Lerma (1), MA Sanz (2), I Moreno (1).A Verdaguer (3)

(1)Laboratorio de Biología Molecular. Departamento de Biopatología Clínica. (2) Hematología Clínica. Servicio de Hematología.(3) Oncología Pediátrica. Hospital Universitario La Fe. Valencia.

El reordenamiento TEL/AML1 causado por la t(12;21) se presenta en el 20-30% de las LLA-B infantiles (Camitta BM et al Semin Oncol 1997;24:83) y en el 3% de las LLA de los adultos (Sallan SE et al. American Society of Hematology 1997;103). La traslocación habitualmente escapa a la citogenética clásica, dependiendo su detección de las técnicas de FISH o métodos moleculares (Mauvieux L et al Rev Clin Exp Hematol 1997;2:3-26). El punto de ruptura en el gen TEL se produce en el exón 5, y el de AML1 puede presentarse en el exón 2 o en el intron 2. Existe una forma de splicing que causa la pérdida de 39 nt del exón 2 (van Dongen JJM et al. Leukemia 1999; 13:1901). La traslocación está asociada con un pronóstico evolutivo favorable (Camitta BM et al Semin Oncol 1997;24:83).

Se pone a punto un procedimiento de PCR en tiempo real con empleo del LightCycler (Roche) utilizando los cebadores TEL2 y AML1-R3 (M1) de Satake N et al (Br J Haematol, 1997;97:607) situados sobre los genes TEL y el exón 3 de AML1, respectivamente, y de la pareja TEL2 y X2AML* (M2), en la que este último cebador se sitúa sobre una secuencia corta del exón 2 de AML próxima al punto de ruptura. Las sondas detectoras donante, TEL 3FL marcada con fluoresceína en su extremo 3’, y la aceptora, TEL 5LC marcada con Red640 en su extremo 5,’ se sitúan sobre el gen TEL y están separadas por dos nucleótidos. Las curvas patrón se preparan realizando diluciones sucesivas 10-1, desde 10-3 a 10-9 del plasmido TOPO II PCR(TELAML1) (Invitrogen) en el que se ha clonado el producto TEL/AML1 de un paciente. La reacción se efectúa en un volumen de 10 m l, empleando 1 m l de del mix FastStart DNA master Hybridization Probes (Roche), 0.4 m M de los cebadores M1 o M2, 0.2 m M de cada una de las sondas, 0.5 m l (0.5 U) de Uracil-DNA glicosilasa (Roche) y 2 m l del cDNA de la muestra. El programa de PCR realiza 45 ciclos (58º C 10 s, 72º C 9 s y 95º C 0 s) y tiene una duración de 45 minutos. Se realiza lectura de la fluorescencia F2/F1 en el anillamiento. Los cebadores M1 generan un producto de 214 pb pero también un producto de splicing de 175 pb, mientras que con los M2 se forma un producto único de 134 pb. El ensayo tiene sensibilidad para detectar 4 copias del plásmido Las curvas patrón obtenidas en cinco ensayos sucesivos realizados en 15 días tienen CCL de -1, pendiente (media± sd) –3.26± 0.15 y término independiente (media± sd) de 31.47± 0.81. La precisión intraensayo obtenida efectuando 10 repecitiones d de e la misma muestra arroja un cv de 0.74 % para el Uc (23.11± 0.17 ciclos) y 11.8% expresado en fg (39154± 46.25 fg/ m l cDNA). Se ha efectuado el ensayo en la muestra de un paciente en el momento del diagnóstico detectándose una concentración 400 fg TEL-AML1 y 2413 fg del gen de control AML1 (16.5% TELAML1/AML1).

Se concluye que el procedimiento establecido tiene los requerimientos de especificidad, reproducibilidad, sensibilidad y rapidez requeridas para el diagnóstico y monitorización del reordenamiento TEL/AML1 de las LLA pediátricas.

Este estudio está promovido gracias a la ayuda FIS concedida al proyecto de investigación 99/0806