CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA b TALASEMIA CON EL EMPLEO DE PCR EN TIEMPO REAL Y SONDAS MARCADAS CON FLUORÓGENOS.

I Moreno1, P Bolufer1, ML Pérez2, MA Sanz2.

1Laboratorio de Biología Molecular (Depto. de Biopatología Clínica) y 2Servicio de Hematología del Hospital Universitario La Fe de Valencia.

El diagnóstico molecular de la b talasemia mediante los sistemas tradicionales (ARMS, enzimas de restricción, reverse dot blot con sondas específicas) se basa en procedimientos largos y costosos que eventualmente utilizan marcajes radioactivos (Arcasoy M et al. Sem in Hematol 1999). Dado que un reducido grupo de mutaciones [CD-39(C® T), IVS-I-110(G® A), IVS-I-6(T® C) y IVS-I-1(G® A)] son las responsables de cerca del 80% de los alelos b talasémicos en el área mediterránea (Cao A et al. Br J Haematol 1989), presentamos un nuevo sistema para su detección mediante el empleo de sondas de hibridación marcadas con fluorógenos específicas para cada mutación.

El sistema se basa en la amplificación de un único fragmento del gen de la b globina y la utilización de una pareja de sondas específicas para cada mutación. Estas sondas emiten fluorescencia sólo cuando ambas han hibridado (FRET: resonancia de la fluorescencia mediante transferencia de energia). A continuación de la amplificación (45 min), se efectúa la curva de fusión (melting) que se basa en la hibridación de las sondas (45-50ºC) al producto de amplificación seguida de la lectura continua de fluorescencia durante el aumento progresivo de la temperatura. Las temperaturas máximas de las curvas de fusión permiten diferenciar el alelo normal y el mutado. El estudio se realizó en muestras de ADN de 60 pacientes (20 con la mutación CD-39, 20 con la IVS-I-6, 10 con la IVS-I-110 y 10 con la IVS-I-1) ya tipificados mediante el método de referencia consistente en la amplificación de un fragmento del gen y digestión enzimática (Moreno I et al. Sangre 1998). Tambien se incluyen ADN de 20 pacientes no talasémicos.

En los 60 pacientes determinados con el LightCycler (Roche) se pudo identificar la mutación responsable que coincide con el genotipo obtenido con el sistema convencional. También se comprobó la especificidad de la detección ya que en ninguno de los pacientes no talasémicos estudiados se detectaron alteraciones. Con el empleo de estas sondas tambien se pueden detectar otras mutaciones localizadas en la secuencia reconocida por las sondas tal como el caso de la mutación CD-37(G® A) que se detecta con las sondas diseñadas para la mutación CD-39.

El método presentado permite en un solo paso la detección rápida (60 min), simple y específica de las mutaciones más frecuentes de b -talasemias de nuestro entorno. Este procedimiento aparte de realizar el diagnóstico molecular de las talasemias, puede permitir puede facilitar la realización de estudios de escreening poblacionales.

Trabajo parcialmente financiado por ROCHE Diagnostics S.L.