DESARROLLO DE UN ENZIMO-INMUNO ENSAYO PARA LA CUANTIFICACIÓN DEL INTER-a-INHIBIDOR DE LA TRIPSINA EN MUESTRAS PLASMÁTICAS Y HEMODERIVADOS DE USO TERAPÉUTICO

S. Grancha, M. Massot.

Área Investigación y Desarrollo. Instituto Grifols S.A. Barcelona.España.

El Inter-a-Inhibidor de la Tripsina (ITI) es un inhibidor de serín-proteasas presente en plasma bajo dos formas mayoritarias de 125 kDa (pre-ITI) y 225 kDa(ITI). A pesar de su elevada concentración en plasma (500mg/l), su actividad biológica in vivo permanece sin definir, aunque parece estar relacionada con el control de la actividad proteolítica en patologías asociadas a procesos de inflamación severa. En este sentido, se ha propuesto su uso como concentrado terapéutico en este tipo de afecciones. Debido a su estructura proteica, el ITI aparece como proteína acompañante en complejos protrombínicos (PTC) y concentrados de Factor IX de alta pureza (FIX HP) de uso terapéutico, obtenidos mediante cromatografía de intercambio iónico.

El presente trabajo describe el diseño, puesta a punto y validación de un enzimo-inmuno ensayo (ELISA) para la cuantificación de este inhibidor. Este método es aplicable a muestras plasmáticas, PTC y FIX HP, así como sus correspondientes intermedios de producción, frente a un estándar plasmático.

El ELISA diseñado emplea como anticuerpo de detección una IgG anti-ITI humano marcado con biotina, la cual debe prepararse mediante reacción con biotina activada y calibrarse adecuadamente. Las rectas de regresión semilogarítmicas obtenidas tanto para muestras de concentrados, como para el estándar plasmático presentan una respuesta paralela en los rangos de concentración establecidos (expresados en unidades de plasma equivalentes, UPE- (2.5x10-4 - 3.1x10-5 UPE/ml). La validación del método analítico muestra que en el citado rango de concentraciones, el ELISA presenta unos niveles de exactitud y precisión adecuados, tanto en referencia a la repetibilidad, como a la precisión intermedia del ensayo. El límite de detección se estima en 4.3x10-6 UPE/ml, mientras que el de límite de cuantificación se sitúa en torno a 1.3x10-5 UPE/ml.

El ensayo descrito permite caracterizar en detalle el contenido de ITI presente en concentrados de Factor IX como proteína acompañante, y evaluar las condiciones óptimas para su eliminación en los procesos de producción de hemoderivados para uso terapéutico.